SawSense.
Financed by:
Implemented by:
About
Surface acoustic wave biosensor based on functionalized graphene with monoclonal anti-alpha-fetoprotein antibody for hepatic cancer diagnostic - SawSense
Objective: to develop a biosensor with surface acoustic waves (SAW) for the detection of alpha-fetoprotein (AFP) used as tumor marker for hepatic cancer diagnosis.
The sensor is based on the chemical selectivity of the matrix, which is crossed by acoustic waves. When the selective matrix interacts with the species to be detected, the mass of the sensitive matrix is loaded and the wave’s amplitude changes, this phenomena representing the detection principle. The project proposes the development of a sensor based on this principle, the selectivity for AFP arousing form the immobilization of antibody on graphene.
The project aims the synthesis of a sensitive matrix (graphene functionalized with monoclonal Anti-α-Fetoprotein antibody), the deposition of the sensitive matrix on the sensor’s surface using laser induced forward transfer (LIFT) technique, sensor’s calibration and signal validation. In order to fulfill these objectives, the execution consortium is composed of researchers from University Politehnica of Bucharest (UPB) and National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics (INFLPR).
The project aims the transition from TRL 2 (concept of SAW sensors with sensitive matrix based on functionalized carbon nanotubes for gas detection) to TRL 3 (laboratory product - SAW biosensor for AFP detection) and TRL 4 (small scale prototype validated in a laboratory environment for a SAW biosensor for AFP detection). The obtained results will be disseminated through the publication of three ISI articles, at least four communications at relevant international presentations and submission of a patent application - SAW biosensor for AFP detection.
This project is financed by UEFISCDI through contract 314PED/2020 and has a value of 600000 RON.
Project partners:
-
Coordinator - University Politehnica of Bucharest (Principal investigator Ioan Stefan Voicu)
-
Partner - National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics (Principle investigator Mihaela Filipescu)
Project manager
University Politehnica of Bucharest
Researcher
University Politehnica of Bucharest
Andrada SERAFIM
Cristina TUNCEL
Results summary
Pentru a studia posibilitatea de interactie necovalenta intre anticorpul monoclonal de alfa fetoproteina si suprafata grafenei, in cazul interactiei necovalente s-au efectuat spectre XPS high resolution pe atomii de carbon si oxigen, prezentate in figura 1.
Modificarile prezente in spectrele high resolution au dovedit interactia chimica dintre anticorp si suprafata grafenei.În continuare, în această secțiune prezentăm cateva tipuri de senzori cu unde acustice de suprafata pe care ii vom evalua in cadrul proiectului in vederea stabilirii sensibilitatii, selectivitatii si timpului de raspuns catre alfa-fetoproteina (AFP). Datorita faptului ca determinarea AFP este foarte necesara pentru diagnosticul precoce al cancerelor hepatice si aproximativ 60% dintre persoanele cu carcinom hepatocelular au valori crescute ale AFP, 50% cu valori mai mari de 100 ng/ml, 30% cu valori mai mari de 1000 ng/ml si 20% cu valori mai mari de 10000 ng/ml, in acest proiect vom considera aceste valori ca fiind referinte de sensibilitate pentru biosenzorii dezvoltati.
Figura 1. Analiza XPS a grafenei functionalizate necovalent cu anticorpul monoclonal de alfa fetoproteina
Sensibilitatea rezonatorilor SAW este dependentă de cantitatea de vapori absorbită de membrana activa şi, de asemenea, de abilitatea inerenta a senzorilor SAW de a răspunde la schimbările fizice din membrana activa. Prin urmare, este foarte important ca membrana activa să aibă grosimea şi rugozitatea adecvata. Pentru a îndeplini aceste cerinţe s-a făcut apel la tehnicile laser, care au revoluţionat studiul materialelor, făcând posibila proiectarea şi integrarea de noi materiale cu proprietăţi adaptate pentru dezvoltări tehnologice de actualitate.
In consecinta, in vederea atingerii limitelor de detectie mentionate anterior este foarte importanta alegerea tipului de senzor SAW precum si caracterizarea sa detaliata inaintea depunerii membranei active.
In aceasta faza ne-am desfasurat activitatea de cercetare in doua directii: i) depunerea de straturi subtiri de SiO2 prin tehnica depunere laser pulsata (PLD) si ii) iradieri laser ale substraturilor de Si si am evaluat in principal morfologia suprafetelor obtinute in vederea integrarii ulterioare in senzori SAW. Caracterizările morfologice au fost efectuate prin microscopie de forță atomică (AFM) și microscopie electronică cu baleiaj (SEM). Imaginile optice au fost obținute cu un microscop Axiovert 200 cuplat la o cameră Carl Zeiss AxioCam MRm. Au fost efectuate măsurători AFM (XE 100 AFM de la Park) în modul non-contact pentru a analiza suprafața modificata laser. Microscopia electronică cu baleiaj (SEM) a fost utilizată pentru a analiza mai detaliat morfologia suprafațelor modificate laser.
Pentru realizarea de structuri de tipul TFBAR au fost utilizate substraturi de Si (001) (imagine AFM in Fig. 2 a)) cu grosimi de 380 µm acoperite pe ambele parti cu un strat de Si3N4 cu grosime de 1 µm. Inaintea procesarii laser, substraturile au fost curățate cu grijă într-o baie ultrasonică și uscate prin suflare cu gaz N2 înainte de utilizare.
Una dintre suprafetele substratului a fost acoperita, secvential, cu un electrod de Al (grosime 100 nm), un film de AlN de 1 µm si apoi cel de-al doilea electrod de Al cu grosime de 100 nm. Ambele filme de Al au fost depuse prin depunere laser pulsata (PLD) sau sputtering asistat de radio frecventa dintr-o tinta de Al in atmosfera de Ar. Filmul de AlN a fost depus prin PLD dintr-o tinta cu puritate 99,99% in atmosfera de N2/Ar pastrand temperatura substratului la 400°. Dupa depunere, intregul substrat a fost incalzit la 500° pentru 1 ora. Electrodul superior a fost configurat folosind tehnica “lift-off”. Membranele rezonante au fost obtinute prin corodarea cu solutie de KOH la 80 °C a Si. Membranele rezultate au margini bine definite si sunt regulate. Frecventa de rezonanta a structurii Si3N4/Al/AlN/Al TFBAR a fost masurata cu ajutorul unui Network Analyzer si este prezentata in Fig. 2.
Figura 2. stanga) Imagine AFM a suprafetei de Si; centru) imagine SEM a unui TFBAR (dimensiunea structurii este de 500µm); dreapta) Frecventa de raspuns a TFBARna
Senzorii cu unde acustice de suprafata au fost realizati in doua configuratii diferite: rezonatori si delay line (exemple in Fig. 3 a) si b)). Procesul de fabricare este asemanator pentru ambele si este prezentat pe scurt in continuare.
Figura 3. Senzori cu unde acustice de suprafata a) rezonator si b) delay-line
Structurile de senzori au fost implementate pe un substrat de cuart (350 si 500 µm grosime) si electrozii au fost transferati prin fotolitografie folosind polimerul polimetilmetacrilat PMMA si iradiere UV pentru a obtine o rezolutie buna. Electrozii sunt realizati din filme de Al depuse prin sputtering asistat de radio frecventa dintr-o tinta de Al de puritate 99.999 % si intr-o atmosfera de Ar (grosime 100 nm). La final a fost aplicat un proces de lift-off care permite obtinerea de traductori interdigitali cu diferite caracteristici.
Vom folosi un rezonator standard cu 2-porturi care functioneaza la o frecventa aproximativa de 405.4 MHz. Dimensiunea cavitatii este de 2610 µm, lungimea de unda de 8 µm, iar traductorii 800 µm. Rezonatorul este testat cu un Network Analyzer HP 8753A si se inregistreaza parametrul S21 (Fig. 4).
Figura 4. Frecventa de raspuns a unui rezonator cu 2 porturi
Pentru alegerea modalitatii optime de prelucrare a suprafetei, care sa asigure o aderenta maxima a grafenei la substratul senzorului, investigam, cu ajutorul software-ului Helios care a fost achizitionat in aceasta faza de realizare a proiectului, interactiunea fasciculului laser cu suprafata substratelor de Si la diferite lungimi de unda si fluente laser aplicate.
REZULTATE FINALE PRIVIND TEHNOLOGIA DE OBȚINERE A SENZORULUI PENTRU DIAGNOSTICUL CANCERULUI HEPATIC
Procedeul de realizarea a senzorului pentru detecția AFP, conform invenției, constă în:
a) Realizarea de soluție de grafenă dispersată prin ultrasonare (5% raportat la solvent), grafena fiind funcționalizată cu grupări amino;
b) Funcționalizarea grafenei cu grupări amino imobilizate pe suprafață cu glutaraldehidă (raport masic grafenă : glutaraldehidă = 2 : 1), în același solvent (DMF), prin agitare mecanică timp de 4 ore la 600 rpm, la o temperatura de 10 °C;
c) Filtrarea grafenei funcționalizate în vederea izolării acesteia pe membrane din Naylon și pentru purificarea de urmele de glutaraldehidă nereacționată;
d) Spălarea grafenei cu apă deionizata pe hârtie de filtru – 5 spălări succesive;
e) Prepararea unei dispersii de grafenă în apă (concentrație 1%) prin ultrasonare;
f) Adăugarea de anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteină (5% masic față de grafenă) și menținerea la o temperatura de 5 °C timp de 72 de ore sub agitare (200 rpm);
g) Filtrarea grafenei funcționalizate în vederea purificarii de urmele de glutaraldehidă nereacționată;
h) Fabricarea de filme subțiri donoare in stare lichida ce conțin grafena funcționalizată si glicerol ce împiedica uscarea prin tehnica centrifugării, cu grosimi de 10 µm. Ca substrat se folosește o placă de cuarț acoperita in prealabil cu un strat de titan de 20 nm.
i) Pregătirea structurilor de cuarț (receptoare) cu unde acustice de suprafață, prin mascarea electrozilor cu parafină;
j) Tratarea suprafeței de cuarț cu hexametildisilazan prin retroîmprăștiere la o viteză de rotație de 2000 rpm;
k) Iradierea filmului lichid cu grafene functionalizate cu un fascicul laser provenind de la un laser cu KrF ce funcționează la lungimea de undă de 248 nm si are 20 ns durata pulsului.
l) Pentru realizarea pixelilor ce acoperă electrozii de aur a fost folosită o fluență laser de 100 mJ/cm2.
m) În timpul realizării transferului laser, atât placa de cuarț cu filmul lichid ce conține grefane functionalizate cât și electrozii de aur au fost menținute în aer.
n) Placa de cuarț cu filmul lichid ce conține grefane functionalizate cât și electrozii de aur sunt așezate pe o masa de translație xyz, paralel și la o distanță de 100 µm una de celalaltă.
o) Obtinerea unui film de grafenă funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteina pe suprafața biosenzorului, suprafața ce a fost tratată in prealabil cu hexametildisiloxan prin spinning la 4000 rpm, dintr-un volum de soluție de 5 ml;
p) Îndepărtarea protecției de parafină de pe electrozi.
În continuare este prezentat un exemplu de biosenzor cu unde acustice de suprafață acoperit prin tehnica de transfer indus de laser cu grafena funcționalizata cu anticorp monoclonal de AFP, conform invenției:
- Fig. 1, schema biosenzorului cu material activ grafena funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteină care este depusă pe suprafața biosenzorului cu unde acustice de suprafață (SAW) prin transfer direct indus de laser (LIFT);
- Fig. 2, imagine obținută cu microscopul electronic cu baleiaj a unui biosenzor cu unde acustice de suprafața acoperit cu material activ grafena funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteină care este depusă pe suprafața biosenzorului prin transfer direct indus de laser la fluența laser de 100 mJ/cm2;
- Fig. 3, grafic ce reprezintă frecventa de răspuns a unui biosenzor cu unde acustice de suprafață acoperit cu material activ grafena funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteină care este depusă pe suprafața biosenzorului prin transfer direct indus de laser.
Referitor la Fig. 1, biosenzorii cu unde acustice de suprafața acoperiți cu material activ grafena funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteină sunt alcătuiți din elementele prezentate în continuare:
-
(1) Placa de cuarț cu grosimea de 500 µm pe care au fost depuși în prealabil electrozi de Au (2) cu o grosime de 100 nm. Suprafața de cuarț a fost tratata cu hexametildisilazan prin retroîmprăștiere la o viteză de rotație de 2000 rpm, si electrozii au fost mascați cu un strat de 20 nm de parafină;
-
Prin tehnica transfer indus cu laserul a fost depus un film de grafenă funcționalizată cu anticorp monoclonal anti-alfa-fetoproteina (3) pe suprafața biosenzorului;
-
Acoperirea senzitiva (4), alcatuita din grafena (5) functionalizata cu anticorp monoclonal pentru alfa-fetoproteina (6)
Referitor la Fig. 3, confirmarea funcționalității biosenzorului cu unde acustice de suprafața se realizata prin înregistrarea parametrului S21 folosind un Network Analyzer. Biosenzorul funcționează la o frecventa aproximativa de 405.4 MHz. Dimensiunea cavității este de 2610 µm, lungimea de unda de 8 µm, iar traductorii 800 µm.
Dissemination
ISI Scientific Papers
A. Palla-Papavlu, S.I. Voicu, M. Dinescu, Sensitive materials and coating technologies for surface acoustic wave sensors, Chemosensors, 2021, 9, 105, https://doi.org/10.3390/chemosensors9050105, IF 3,398
A.F. Bonciu, M. Filipescu, S.I. Voicu, T. Lippert, A. Palla-Papavlu, Facile Fabrication of Hybrid Carbon Nanotube Sensors by Laser Direct Transfer, Nanomaterials, 2021, 11, 2604, https://doi.org/10.3390/nano11102604, IF 5,076
Conferences
C. Tuncel, M. Oprea, A.M. Pandele, S.I. Voicu, Alpha-fetoprotein functionalized multi walled carbon nanotubes for the fabrication of surface acoustic wave sensors, The International Symposium PRIOrities of CHEMistry, Bucharest, October 27 - 29, 2021, online event, poster presentation.
M. Oprea, A.M. Pandele, S.I. Voicu, A. Palla-Papavlu, Alpha-fetoprotein monoclonal antibody-functionalized graphene for the fabrication of surface acoustic wave sensors, The International Symposium PRIOrities of CHEMistry, Bucharest, October 27 - 29, 2021, online event, poster presentation
Voicu, S.I., Pandele, A.M., Oprea, M. & Tuncel, C., Laser printing of alfa-fetoprotein monoclonal antibody functionalized graphene for surface acoustic wave biosensors, EMRS Spring Meeting, oral communication, Abstract number ZNQPF, online event, 30 May-3 June 2022.
Voicu Ioan Stefan, Palla-Papavlu Alexandra, Antoniac Vasile Iulian, Miculescu Florin, Semenescu Augustin, Costoiu Mihnea Cosmin, Mates Ileana-Mariana, Prisecaru Delia -Alexandra, Surface acoustic wave biosensor based on graphene functionalized with anti-alpha-fetoprotein monoclonal antibody, for the diagnostic of liver cancer, The 7th Annual iCAN 2022, poster, Toronto, Canada, July 2022.
Patent application
VOICU Ioan Stefan, PALLA-PAPAVLU Alexandra, ANTONIAC Vasile Iulian, MICULESCU Florin, SEMENESCU Augustin, COSTOIU Mihnea Cosmin, MATES Ileana-Mariana, PRISECARU Delia -Alexandra, BIOSENZOR CU UNDE ACUSTICE DE SUPRAFAȚA PE BAZA DE GRAFENĂ FUNCTIONALIZATĂ CU ANTICORP MONOCLONAL ANTI-ALFA-FETOPROTEINĂ, PENTRU DIAGNOSTICUL CANCERULUI HEPATIC, A00208/20.04.2022
Team
Stefan Ioan VOICU
Andreea Madalina PANDELE
Researcher
University Politehnica of Bucharest
Project manager
University POLITEHNICA of Bucharest
Andrada SERAFIM
Researcher
University Politehnica of Bucharest
Cristina TUNCEL
Researcher
University Politehnica of Bucharest
Mihaela FILIPESCU
Principal investigator,
National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics
Alexandra PALLA-PAPAVLU
Researcher
National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics
Maria DINESCU
Researcher
National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics
Carmen Valentina DINCA
Researcher
National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics
C. Tuncel, M. Oprea, A.M. Pandele, S.I. Voicu, Alpha-fetoprotein functionalized multi walled carbon nanotubes for the fabrication of surface acoustic wave sensors, The International Symposium PRIOrities of CHEMistry, Bucharest, October 27 - 29, 2021, online event, poster presentation.
M. Oprea, A.M. Pandele, S.I. Voicu, A. Palla-Papavlu, Alpha-fetoprotein monoclonal antibody-functionalized graphene for the fabrication of surface acoustic wave sensors, The International Symposium PRIOrities of CHEMistry, Bucharest, October 27 - 29, 2021, online event, poster presentation